検証には、鬼越トマホーク、フルーツポンチ・村上健志、三四郎、ラブレターズ、カカロニ・栗谷、リンダカラー∞ ・Den、や団・ロングサイズ伊藤ら、総勢24名の芸人が参加。チーム吉本、チームマセキ、チームものまね、チームチャンピオン、チーム金、チームキャラと、多彩なメンバーが6チームに分かれ、賞金300万円をかけたチーム戦を繰り広げる。
本番組は、「寝起き」と「完徹後」という対照的な状態での“面白さ”を比較するため、2つのステージで進行。しっかりと睡眠をとっている芸人たちは深夜1時に突然起こされ、とろサーモン・久保田かずのぶ、令和ロマン・松井ケムリがMCを務める『覚醒～寝起最強芸人決定戦～』の収録に参加することに。
寝起きの状態で大喜利やネタ、リアクション芸に挑戦する中、収録の終盤で、これはニセ番組であることが明かされ、「今と同じことを36時間後にもう一度やってもらう」という衝撃のルールが告げられる。ここから芸人たちは、36時間一切眠ることが許されない過酷な状況へ突入。眠れば即脱落という極限状態の中で、睡魔との戦いが幕を開ける。
そして36時間後、生き残った芸人たちが、いよいよ本番となる『完徹～不眠最強芸人決定戦～』へ。「ABEMA」のオリジナル番組で初MCを務める麒麟・川島明を中心に、見届け人の久保田かずのぶ、ゲストにゆうちゃみと私立恵比寿中学の小久保柚乃も参加します。モノボケやネタを披露する際には、まさかのゲストも登場し、思わず覚醒する芸人の姿も…？一睡もせずに再びお笑いに挑む芸人たちは果たしてどんな姿を見せるのか。

そして、『完徹～不眠最強芸人決定戦～』でMCを務める川島からコメントが到着。「地上波では絶対できない」「36時間寝ないことで覚醒した芸人さんがいたり、36時間寝てない人よりイカれたゲストが出てきた瞬間も何度かありました。その辺も一筋縄では終わっていないので、ぜひご覧いただきたいです」と、芸人たちの激闘を語っている。
■川島明（麒麟）コメント全文

地上波では絶対できないんじゃないかな。医療チームも存分にスタンバイした中で、自分がプレーヤーだったら絶対に出ないなっていうぐらいのクオリティでした。そんな中でも、36時間寝ないことで覚醒した芸人さんがいたり、36時間寝ていない人よりイカれたゲストが出てきた瞬間も何度かありました。その辺も一筋縄では終わっていないので、ぜひご覧いただきたいです。
